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原创：

STEMCELL TECHNOLOGIES很高兴向您宣布推出三个新的EasySep™试剂盒，这是STEMCELL在非人灵长类（NHP）的第一批成品（OTS）的细胞分选产品。 678体育 以前将这些分选试剂盒作为定制产品提供，现在将它们作为成品提供，为使用非人灵长类样本的客户提供更多的便利。

产品信息

产品描述

这些产品在不过柱的情况下，可在短短20分钟内从新鲜或冷冻的非人灵长类的PBMC中分离出T细胞亚群。

产品规格

正装包含1管抗体混合物和2-3管EasySep™磁珠（＃19250），正装可处理1 x 10^9个细胞。试用装可处理3 x 10^8个细胞。

产品优势

快速、无柱：20至25分钟，比Miltenyi产品快2-3倍；

简单： 没有上游清洗步骤，只需一个抗体混合物；

没有生物素：与下游实验的一致性和兼容性更高；

方便：客户现在可以更快、更简单的订购这些成品试剂盒，而不需要走定制流程。

产品性能和竞品情况

磁极兼容性

EasySep™非人类灵长类T、CD4+T、CD8+T细胞分选试剂盒可兼容磁极：

EasySep™磁极；

“The Big Easy”EasySep™磁极；

RoboSep™-S。

要使用EasySep™其他磁极分选非人灵长类免疫细胞，请联系PSS

技术要点

样本来源：在PBMC样本上已经过优化，从以前的定制情况上看，这些试剂盒在定制时也已成功用于淋巴结和脾脏样品。

样本准备

对于超过 24小时的外周血样本，在细胞分选之前需要用氯化铵裂解红细胞；

对于冻存的PBMC，在细胞分选之前，需要对样本进行DNAse I处理并过滤；

对于小体积样本，建议使用标准的15 mL锥形管（＃38009），而非SepMate™，以提高PBMC的回收率；

分离PBMC时，Lymphoprep™的浓度因物种而异：

恒河猴，使用100%浓度Lymphoprep™；

食蟹猴，使用D-PBS（不含Ca ++和Mg ++）将Lymphoprep™稀释至90％，以减少单个核细胞层的红细胞和粒细胞污染。

流式细胞染色和设门注意事项

由于存在红细胞残留，因此需要使用CD45抗体（特别是克隆号D058-1283）（强烈建议）

还需要使用细胞活性染料（强烈建议）

目标市场

工业和科研在使用非人类灵长类动物模型研究的免疫学研究领域，包括：

传染病（例如艾滋病毒/艾滋病，结核病，黄热病）；

自身免疫性疾病，尤其是需要纵向研究的慢性疾病（例如多发性硬化）；

移植；

免疫治疗；

毒理学。

交叉销售

市场宣传材料和销售支持

手册：；

宣传单：；

网站：和。

产品目录价

原创： STEMCELL

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是最常见的神经退行性疾病。Alzheimer's association（AAIC）的数据显示：

l AD是美国排名第六的致死原因。

l AD患者的看护需要大量的精力，也给家庭带来了巨大的经济负担。

l 2000-2017年间，死于心脏疾病的患者下降了9%，而死于AD的患者增加了145%。

l 每3个老年人中就有1个死于AD或者另外一种痴呆（dementia）。

l 2019年，AD和dementia在美国预计的花费为2900亿美金，这个数字预计会在2050年到达11000亿美金。

l 2019年，美国AD患者的人数在580万，这个数字预计在2050年到达接近1400万。

*数据来源：2019 Alzheimer's Disease Facts and Figures Report

引起AD的原因目前尚未明确，疾病发展目前认为与大脑中的Beta-Amyloid和Tau蛋白有关，近期也有研究认为大脑中的免疫细胞 - 小胶质细胞可能介导了Tau蛋白聚集。目前AD的研究工具包括原代神经元，转基因动物模型，3D脑类器官等。

3D脑类器官

灵长类动物的大脑是高度复杂和有组织性的结果，2D的原代神经元模型包括hPSC衍生的神经元模型重现脑组织复杂结构的能力较为有限，而啮齿类动物（包括小大鼠）与灵长类动物的大脑相比结构更加简单（不含有OSVZ区域）。hPSC衍生的脑类器官则是一种三维（3D）体外培养系统，能够重现人脑发育过程和发育中的人脑结构。它们提供了一种模拟人体生理环境的体外模型，专用于研究人神经系统特有的神经发育和疾病过程。

而从FAD和一些SAD病人的iPS衍生的神经元具有Tau蛋白的磷酸化水平升高和Beta-Amyloid聚集，从AD病人来源的3D脑类器官也同时具有Beta-Amyloid的聚集和类似neurofibrillary tangles的Tau磷酸化水平升高。因此，近期也有很多科学家使用3D脑类器官进行AD的相关研究。

STEMdiff™脑类器官试剂盒为无血清培养系统，用于从人ES和iPS生成脑类器官。它是基于由Madeline Lancaster和Jürgen Knoblich教授所发布的配方¹。

图1. 使用STEMdiff™脑组织类器官试剂盒生成的脑组织类器官

（A）使用STEMdiff™ 脑组织类器官试剂盒在第40天生成的整个脑组织类器官的相位对比图。箭头所指处为皮层类似区域。（B）免疫组化分析结果显示这些皮层类似区域具有顶祖标志物PAX6（红色）和神经标志物β-tubulin III（绿色）。（C-F）（B）图框内区域的放大图像。（C）PAX6 (红色) / β-tubulin III (绿色)。（D） CTIP2 (红色) / β-tubulin III (绿色)。（E）和（F）Ki-67（绿色）和核染料DAPI（蓝色）共同标记的增殖中的组细胞。（F）室下区类似区域可见一个额外的Ki-67+细胞群。比例尺=（A）1 mm，（B）500 µm 和（C-F）200 µm。在培养脑类器官时，与那些未经质控的自配试剂相比，该试剂盒显著提升了类器官（包括从难分化的细胞系）形成的效率（图2）。

（A）图2. 与使用未经质控的试剂所生成的脑类器官相比，使用STEMdiff™脑类器官试剂盒生成的脑类器官在质量、产量和标志物表达上的表现都更为优异。

（A）使用STEMdiff™脑类器官试剂盒生成的脑类器官，在第40天发展出厚组织样结构，且直径超过 1 mm。（B）使用未经质控的试剂生成的类器官在第40天并未发育出厚组织，而是形成了较大的含液胞囊。（C）RT-qPCR分析显示，在使用STEMdiff™脑类器官试剂盒所生成的脑类器官中，神经祖细胞与成熟神经元出现上调；（D）对比之下，采用未经质控的试剂生成的类器官显示出较差的神经元标志物表达（平均数 ± SEM，每个细胞系的n = 2；每个分析涉及6个类器官）。数据以18S/TBP为标准，并与未分化的hPSC对照组相比较。（A）和（B）的比例尺 = 1 mm

已使用脑类器官进行造模的疾病有：

l 小头畸形²

l ZIKA病毒诱导的小头畸形^3-6

l 可卡因的作用⁷

l 自闭症谱系障碍/提摩西综合症⁸

l 阿尔茨海默病⁹

l 小胶质瘤¹⁰

^l Miller-Dieker综合症^11-12

如何从人多能干细胞生成脑类器官？

如何从人多能干细胞生成脑类器官的详细操作步骤，包括类胚体的形成、神经诱导、神经上皮扩张和类器官的成熟（图3）。

图3. 脑类器官生成示意图

将在mTeSR1™中维持培养的人多能干细胞（胚胎干细胞或诱导多能干细胞）使用温和细胞解离试剂（GCDR）解离为单细胞悬液，以密度为9000细胞/孔接种至U-Bottom 96孔超低粘附培养板（Corning®）中，接种培养基为EB形成培养基 + 10 μM Rho-kinase抑制剂（ROCKi）。每隔2天更换为不含ROCKi的EB形成培养基。5天之后，将EBs转移到含有诱导培养基的24孔超低粘附培养板（Corning®）中。对EB培养2天后，使用液体Matrigel®（减少生长因子，Corning®）包被EBs。接下来将它们转移到经过无组织培养处理的6孔板（12-16类器官/孔）中。嵌入的类器官在扩张培养基中维持培养3天。在第10天时，将类器官转换到成熟培养基中，然后放置在RPM为57-95的定轨摇床（Infors HT）上对其进行培养。在成熟培养基中，每3-4天进行换液。在第40天时，类器官进行RT-qPCR分析或冰冻切片后进行免疫染色。EBs形成、诱导和类器官扩张的比例尺 = 300 μm。类器官成熟的比例尺 = 1 mm。

原代神经元培养
标准化的神经元培养添加物（如Brewer's B27）包含了多种复杂的成分13-15。这些原料及相关制造过程的质量差异性都将导致该添加物的品质的变化，已有报道表明该情况会对神经元培养造成负面影响15，16。

NeuroCult™ SM1（STEMCELL优化后的）是根据已发表B27配方1开发设计的，且经过优化，对于支持成熟神经元的培养具有更出色的一致性（图4）。NeuroCult™ SM1神经元培养基添加物的设计和生产均为培养出可重复的、高品质的培养物做了充足的准备。在开发过程中，678体育 首先对已发表的添加物进行了多因素实验13,14，确定NeuroCult™ SM1的配方和原料的精确规格。精选的原料由可靠的供应商提供，并选用适当的重组或合成原材料作为组分的替代物。随后，建立最佳的制造工艺来生产这些多组分添加物。

图4. 使用SM1培养体系培养的大鼠原代神经元具有突触前和突触后标志物的表达

在SM1培养体系中培养的E18大鼠原代皮层神经元。在培养第21天，神经元表型成熟，具有广泛的树突棘表达和树突前标志物synapsin（A，C；绿色）和树突后标志物PSD-95（A，B；红色）的表达和分布。Synapsin集中在神经元胞体和轴突上分散的小突分布，轴突由MAP2（A，D；蓝色）标记。

与竞品（添加有B27的Neurobasal^®）相比，SM1培养系统中具有更多β-微管蛋白III阳性表达的神经元，细胞活力显著提升（图5），并且SM1批次间的稳定性要更好。另外，678体育 发现神经元在添加有SM1的培养基中具有更多的神经突生长/分支，以及正常的电生理特征（实验数据未显示）。

图5. SM1培养体系可大大提高细胞存活率

（A）在SM1培养体系或竞品体系（添加有B27的Neurobasal^®）中培养21天的E18大鼠原代皮层神经元。在SM1体系中培养的神经元数量显著性高于竞品体系（n=4；mean ± 95% CI；*p < 0.05)。（B）在添加有SM1或B27类似竞品（竞品1，2，3）的Neurobasal^®中培养21天的E18大鼠原代皮层神经元。使用SM1培养的神经元数量与竞品相当，但批次间的稳定性较高。

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Do your neurons fire together?

图6. 在BrainPhys™完全培养基（BP）、Neurobasal®完全培养基（NB）、突触抑制剂（BP+抑制剂）和咖啡因（BP+咖啡因）条件下培养的神经元的平均连接率。

n=3（每个条件下进行了3次独立的细胞实验）；one-way ANOVA，F(3,8) = 854，P<0.0001，使用Tukey's multiple comparisons检验：ns=不显著，∗∗∗∗P < 0.0001。图片引用自Saber WA et al. (2018) All-Optical Assay to Study Biological Neural Networks. Front. Neurosci. 12:451. doi: 10.3389/fnins.2018.00451的图4D。遵循CC BY 4.0. Copyright © 2018 Afshar Saber, Gasparoli, Dirks, Gunn-Moore and Antkowiak。

参考文献

1. Lancaster M et al. (2014) Nat Protoc 9(10): 2329-40.

2. Lancaster MA et al. (2013). Nature 501(7467): 373-9.

3. Wells MF et al. (2016). Cell Stem Cell 19(6): 703-8.

4. Garcez PP et al. (2016). Science 352(6287): 816-8.

5. Cugola FR et al. (2016). Nature 534(7606): 267-71.

6. Dang J et al. (2016) Cell Stem Cell 19(2): 258-65.

7. Lee CT et al. (2017). Neuropsychopharmacology 42(3): 774-84.

8. Mariana J et al. (2015) Cell 162(2): 375-90.

9. Raja WK et al. (2016) PLoS One 11(9): E0161969.

10. Hubert CG et al. (2016) Cancer Res 76(8): 2465-77.

11. Bershteyn M et al. (2017) Cell Stem Cell 20(4): 435-49.

12. Iefremova V et al. (2017) Cell Rep 19(1): 50-9.

13. Brewer GJ et al. (1993) J Neurosci Res. 35(5): 567-76.

14. Brewer GJ and Cotman CW. (1989) Brain Res. 494(1):65-74.

15. Chen Y et al. (2008) J Neurosci Methods 171(2):239-47.

16. Cressey D. (2009) Nature 459: 19.